本站原创摘 要：通过正交试验L16(54)分配表(采用5因素4水平进行设计),根据各因素及水平的不同组合,采用固态发酵的方法探索出更加简单、高效的降解木质素的最优化组合方式.并考虑经过一定的生物学方法,探索使其变成一种生物型清洁能源的可行性.
关 键 词：正交试验固态发酵降解最优化
中图分类号：O62文献标识码：A文章编号：1007-3973（2012）001-079-02
1前言
木质素也称木素,是一类高分子有机物质,其在植物界中含量仅次于纤维素,是一种极具潜力的可再生资源.其总与纤维素伴生,具有价廉、无毒、较好的可热塑和玻璃化特性,具有一定的应用前景.秸秆是一种含有丰富纤维素的可再生资源,基本组织是纤维素、半纤维素和木质素.我国农作物秸秆年产量超过6亿吨,除少部分被用于造纸、纺织等行业或用作粗饲料、薪柴外,大部分以堆积、荒烧等形式直接倾入环境,造成极大的污染和浪费.目前为止,超过95%的木质素仍以“黑液”直接排入江河或浓缩后烧掉,很少得到有效利用.因此,对秸秆木质素的研究和利用显得尤为重要.从20世纪初开始,国内外学者一直在寻找降解木质纤维素的最佳途径,涉及的研究方法主要包括：化学法、物理法、物理化学法、生物降解法.而利用微生物降解木质素具有作用条件温和、专一性强、处理成本低等优点,不仅可以有效缓解环境污染,还可以变废为宝,实现资源再利用,已引起了国内外学者的关注.
2材料与方法
2.1材料与设备
(1)实验菌种
实验选用的菌种为白腐菌的典型种黄孢原毛平革菌(P.Chrysosporium),购于广东省微生物菌种保藏中心.
(2)实验材料
土豆(市售)；PDA培养基；溶壁微球菌；木质素；玻璃容器或瓷器；PH试纸；细纱布；胶头滴管；烧杯(50ml,100ml,500ml,1L)；玻璃棒；普通漏斗；定性快速滤纸；量筒(5ml,100ml,500ml,1L)；坩埚；称量瓶；KH2PO4(2.0mgmL-1)；MgSO47H2O(0.5mgmL-1)；酒石酸铵(0.2mgmL-1)；微量元素液(70mLL-1).其中微量元素液的成分为NaCl(1.0mgmL-1),CoCl26H2O(0.18mgmL-1),Na2MoO42H2O(0.01mgmL-1),ZnSO47H2O(0.1mgmL-1),CaCl2(0.1mgmL-1),CuSO45H2O(0.01mgmL-1),MnSO4H2O(0.5mgmL-1),FeSO47H2O(0.1mgmL-1),AlK(SO4)212H2O(0.01mgmL-1),MgSO47H2O(3.0mgmL-1),HBO3(0.01mgmL-1),NTA(115mgmL-1).
(3)实验仪器
恒温箱；无菌操作台；恒温磁力搅拌加热器；烘箱；抽滤装置；高压蒸汽灭菌锅；粉碎机；电炉；分析天平；电子天平.
2.2实验方法
(1)菌种转接
PDA培养基(PotatoDextroseAgar)：取去皮马铃薯200克,切成小块,加水1000毫升煮沸30分钟,滤去马铃薯块,将滤液补足至1000毫升,加葡萄糖20克,琼脂15克,溶化后分装,15磅灭菌30分钟.
将斜面菌种接种于搁置好的PDA斜面上,于28℃培养5天左右,置于4℃冰箱内保存.
(2)菌种驯化
菌种接种在马铃薯(PDA)琼脂培养基上,待培养5～7d长满孢子后,刮取孢子制成浓度为2.006个mL-1的孢子悬液.取5mL制得的孢子悬液接入麸皮、秸杆与土豆汁质量比为3：7：35(本实验中取秸秆粉1g,土豆汁3.5g)的灭菌固体培养料中,于37℃驯化培养.
(3)配制固态发酵培养液
鉴于国内外其他学者关于黄孢原毛平革菌液体培养条件的研究结果,本实验采用的液体基质的组成成分为：KH2PO42.0mgmL-1,MgSO47H2O0.5mgmL-1,酒石酸铵0.2mgmL-1,微量元素液70mLL-1,pH自然.其中,微量元素液的成分为NaCl1.0mgmL-1,CoCl26H2O0.18mgmL-1,Na2MoO42H2O0.01mgmL-1,ZnSO47H2O0.1mgmL-1,CaCl20.1mgmL-1,CuSO45H2O0.01mgmL-1,MnSO4H2O0.5mgmL-1,FeSO47H2O0.1mgmL-1,AlK(SO4)212H2O0.01mgmL-1,MgSO47H2O3.0mgmL-1,HBO30.01mgmL-1,NTA(氨基三乙酸)115mgmL-1.
(4)固态发酵方法
本试验所采用采用4因素4水平正交试验设计,见表1.4因素分别为A菌种驯化时间、B吐温80的用量、C初始pH、D发酵基质含水率.各因素水平依次为：菌种驯化时间为2d,5d,8d,11d；吐温80的用量为0.1%,0.2%,0.3%,0.4%；PH为2.5,3.0,3.5,4.0；发酵基质含水率为50%,60%,75%,85%.
由此得到以下16组的实验设计方案,如表2所示.
各实验组分别称取3g干秸秆粉作为固体基质,装于相应锥形瓶中,然后依据正交实验设计的各实验方案分别加入不同量的液体基质、吐温80配成固态培养基,灭菌,将菌种按正交实验设计的不同驯化时间驯化后,制成浓度为2.006个mL-1的菌悬液,再按实验要求的接种量接种于上述灭菌固态培养基中,于30℃温度下,培养20d后供测木质素、秸杆结构等理化参数.最后通过极差分析及综合考虑选择出最佳综合培养条件.如果最佳实验条件组是16组正交实验中未做的,故按原实验操作方法及选定的发酵条件进行新实验.
3结果测定
(1)酸不溶木素含量的测定(按GB/T2677.8-94测定).
(2)酸不溶木素中灰分含量的测定(按GB/T2677.3测定).
4结果与分析
4.1正交实验结果(见表3)
4.2红外图谱(见图1)
4.3结果分析
从整个正交实验结果来看,个别数据存在一定误差,其中1-4#样品中酸不溶木素的质量明显小于其酸不溶木素中灰分的质量,很明显误差较大.这可能是由于在测定酸不溶木质素含量时,使用定量滤纸过滤后未将滤纸洗至中性便进行后续实验,导致称取酸不溶木质素质量时只能将其装于烧杯内完成,故使酸不溶木素的质量的测定结果出现了较大偏差.而其中的5#、6#、16#样品可能在其各自的组合条件下并不利于木质素降解酶的产生或所产木质素降解酶的酶活过低,使木质素并未发生降解或降解较少,故结果表现出较高的木质素含量.同时选取了其中4个样品做了红外光谱分析(结果如图1所示),其中1400-1600cm-1之间为木质素的特征吸收峰,从图中可以看出5#和15#样品中木质素并未发生降解或降解及其微少,而7#和11#样品中木质素发生了一定程度的降解,说明了光谱图与正交实验结果基本吻合.
5结语
本实验欲通过正交试验,采用固态发酵的方法探索出更加简单、高效的降解木质素的最优化组合方式,并考虑经过一定的生物学方法,探索使其变成一种生物型清洁能源的可行性.
由于实验条件的限制以及正交实验中个别组合的数据存在一定误差,给结果的分析带来了一定困难.故考虑重新调整实验方法,首先进行单因素温度的考察,选择出最佳培养温度后再重新进行正交实验.由于菌种培养以及驯化耗时较长,而且结果测定时工作量较大,故仍需一定时间才能完成.